ClonePix结合CloneSelect Imager技术加强开发
病毒特异性的杂交瘤细胞
双链DNA病毒引起人类大多数疾病。疱疹病毒和腺病毒家族和乳头瘤病毒在人体中会产生相似的症状。而且，由于病毒抗原基因组的保守，对于特殊病毒的血清学和蛋白诊断确认是非常复杂的。高度的蛋白同源性和血清交叉反应导致双链DNA病毒物种之间区分是非常困难的。本研究的目的是发现识别最优的分泌高度特异性、无交叉反应的单克隆抗体的细胞系，用于生物治疗的开发。
ClonePix系统用来高通量从母本的杂交瘤细胞中（历史数据表明母本的细胞系产量少于1mg/L的单抗）筛选数以百计的亚克隆。分泌高IgG的活细胞进一步用客观评价细胞生长的CloneSelect Imager系统来评估。高效自动化克隆选择技术旨在挽回高滴度的杂交瘤细胞系，这些细胞系能生产抗原高特异性的抗体。ClonePix和CloneSelect Imager配套技术为免疫诊断技术发展提供了足够的病毒抗原的特异性抗体。
材料
l ClonePix System (Molecular Devices, LLC)
l CloneSelect Imager (Molecular Devices, LLC)
l CloneMedia Semi-Solid Media for hybridomas/myelomas (Molecular Devices, LLC Cat #K8600/K8610)
l CloneDetect Reagent, Mouse IgG (H+L) Specific,Fluorescein (Molecular Devices, LLC Cat #K8220)
挽救低产量的杂交瘤细胞
最早的双链DNA 病毒特异性杂交瘤细胞系是1990s用有限稀释方法开发的，但是筛选的杂交瘤细胞单克隆性和稳定性都不是很好。用不同的血清和培养基组分进行多年的重复培养（静态的和旋转的），这些克隆表现出不稳定（图1）。而且，抗体的产率从来没有超过3mg/L。由于在preps中能观察的差别巨大的聚集物，使得纯化的IgG的质量很难保持一致性。
通过亚克隆高滴度抗体的亲本细胞系，挽回和稳定特异性的杂交瘤细胞系。ClonePix技术平台利用半固体培养基和CloneDetect无标记检测技术重筛了大量以前融合的杂交瘤细胞（图2），显示了明显的技术优势。
ClonePix高通量筛选方法能够从低产的亲本克隆细胞中挽回高产、稳定的细胞。
筛选和识别中试规模分析的亚克隆
用合成的具有抗体表位的多肽，对筛选到的前146生长速率的克隆进行抗原特异性分析。多肽和抗体显示了很强的的亲和性，完全符合前期研究的阐释，因此，合成的多肽用来筛选新的，具有高抗体亲和性的亚克隆。
高IgG分泌亚克隆的中试规模生产
7个高价值特异的亚克隆在液体培养基规模化生产。这些克隆被扩增，一旦获得足够的培养基体积，5个亚克隆被冷冻用于将来的研究参考。而剩下的2个高亲和/高IgG分泌克隆继续扩增2-3周，直到完成中试生产（1升）。
挽救低产量杂交瘤细胞的工作流程
为了识别用于发展高级诊断的双链DNA病毒特异抗体的亚克隆，ClonePix技术筛选480FITC阳性的杂交瘤克隆，基于半固体培养基技术和FITC标记的CloneDetect试剂。CloneSelect Imager 识别了其中146个快速生产的克隆，7个高产量的克隆被确认和目标多肽具有高度的特异性。选择其中的2个亚克隆进行中试生产和剩余的5个作为细胞银行。这个流程降低了杂交瘤细胞的筛选时间，最多为常规有限稀释法筛选时间的50%，而且筛选了强健的目标克隆细胞作为其他附加的研究和生产。
单克隆的验证和IgG分泌子的均一化
ClonePix系统再克隆和特异性确认之后，2个亚克隆扩增，重新种到具有CloneDetect试剂的半固体培养基的6孔板中。ClonePix系统成像和分析表明克隆正常的分泌了IgG，同时，通过均相均一化过程，能观察到高产IgG的克隆（图5）。
新双链DNA病毒杂交瘤细胞亚克隆的生产能力
利用ClonePix技术重新筛选低产量的亲本克隆。高产、稳定的亚克隆被挽回。Protein G纯化单克隆抗体，定量总产量。相比亲本克隆的历史产量（~1mg/L），新的亚克隆细胞IgG的产量明显地增加（17-25mg/L），图6显示。
结论
ClonePix技术改善了筛选时间周期和亚克隆杂交瘤细胞的质量，降低手动操作。而且，CloneMatrix Media和CloneDetect 试剂提高了分泌克隆的生长和检测灵敏度。ClonePix的数据表明亲本的低生产力源于小数目生产抗体的细胞被快速、无生产抗体能力的细胞压制。
相比亲本杂交瘤细胞的产量（05-1mg/L）， 结合CloneSelect Imager的使用，ClonePix 系统被证明是能识别高产（17-25mg/L）、高亲和力杂交瘤细胞亚克隆的强有力工具。因此，该技术有助于推进双链DNA病毒特异性的新治疗性抗体的发展。
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