磷酸化是细胞内蛋白质修饰最普遍的一种，在细胞分化、增殖和迁移等过程中起着重要作用。

单细胞细胞内蛋白组解决方案如何解决现有技术面临的许多挑战

了解癌症精准医学中的磷酸化蛋白  

检测磷酸化蛋白的传统技术

Phosphoflow

Mass Spectrometry

Multi-Analyte Profiling

ELISA

Western Blots

Kinase Activity Assay

单细胞细胞内蛋白组检测解决方案

△Figure1.0 IsoSpeak 软件的磷酸化蛋白分析的细胞信号通路分析图

现有的技术因为技术上的瓶颈，带来各种实验设计上的不便。例如，Phosphoflow 使用少数预选好的抗体，再用固定的细胞做分析时，需要较多的样本量才能够达到准确的相关统计，也同时会引入偏倚因素。蛋白磷酸化的步骤，样本前处理和分析前操作步骤也非常复杂，无法进行自动化的检测。

IsoPlexis 因此研发了自动化的单细胞细胞内磷酸化蛋白组检测技术，使得研究人员可一次分析相关蛋白的磷酸化状态。

同时检测500-1500个单细胞内15+的磷酸化蛋白靶标，并做出细胞信号通路的分析。

活细胞直接在芯片上裂解，实时了解细胞内信号通路，去探索肿瘤疾病进展和耐药性机制。

数据使用 IsoSpeak 软件自动分析，芯片上机后24小时内分析和获得就绪的数据和各种分析图。

了解癌症精准医学中的磷酸化蛋白

早期检测相关蛋白生物标志物是癌症治疗预后和预防的关键。蛋白质组学的最新进展帮助科学家更好地研究和理解蛋白质的变化，包括转录后修饰，如磷酸化乙酰化等。通过理解和识别蛋白质的变化，可以发现重要的细胞内通路，这反过来又有助于更有效地寻找癌症生物标志物。

然而许多用于检测蛋白质性质的传统方法只能同时检测到种类有限的蛋白质，而且往往是耗时费力的，并且需要大量的样本。

在这些方法中，蛋白质样本可以通过所带电荷不同进行分离，这样会破坏有关目标蛋白质的信息。 此外，也无法提供所需的灵敏度和可重复性，因为这些技术通常是群组细胞的分析并检测样本中的平均蛋白质水平。为了更好地识别正确的生物标志物和目标蛋白，并了解完整的信号通路图，研究者需要能够研究和检测单细胞水平的蛋白性质。

检测磷酸化蛋白的传统技术

蛋白磷酸化

流式细胞分析(Phosphoflow)

在过去的十年里，蛋白磷酸化流式细胞分析呈指数级增长。这种技术可同时分析磷酸化事件和细胞表面标记，使研究人员能够解决细胞群中复杂的信号网络。蛋白磷酸化流式细胞分析可用于许多领域，包括抗原刺激和微生物研究、高通量和高内涵药物发现，以及正常和疾病状态免疫反应中信号通路的特征。但是，受可检测靶标数量（3-5）和检测荧光的空间重叠问题的限制，该技术也有很大的局限性。

质谱检测：(MS)

基于质谱的蛋白质组检测已成为蛋白质鉴定、表征和定量的首选技术。

即使如此，MS对蛋白质磷酸化的分析仍然远远不够，而且受限于无法区分少量磷酸化蛋白的较弱信号和高丰度非磷酸化蛋白的信号，其结果往往无法达到预期。

多因子分析（微孔板&薄膜）

(Microplates & Membrane)

质谱检测可以同时提供蛋白序列和磷酸化的相关信息，但是，也可以手工分析某些感兴趣特定蛋白的磷酸化，而不需要进行全面的蛋白磷酸化分析。这需要研究人员同时检测几种所需要分析的蛋白磷酸化。

一般来说，这些方法使用磷酸化蛋白特异性抗体，包括基于微板和薄膜的检测方式。这类技术由于不需要进行单个蛋白的Western或传统ELISA的检测，大大提高了检测通量。

这类技术可提供更多数据，同时仅需要很少的样本量。然而，蛋白谱分析通常被认为不如传统分析技术那么灵敏，因为可能存在潜在的抗体交叉反应。尽管检测了大量蛋白质，但它们不能在单细胞水平和低灵敏度下进行量化分析。

酶联免疫吸附分析 (ELISA)

该方法使用针对所感兴趣蛋白质的捕获抗体，不依赖于蛋白的磷酸化状态。添加目标蛋白使其与包被在板上的捕获抗体结合。然后添加检测抗体，可特异性结合在目标蛋白的磷酸化位置。结果通过显色或荧光检测进行分析。这种方法每次可检测的磷酸化蛋白数量有限，需要消耗大量的时间和人力。

Western Blot 

作为较为成熟的技术，这种方法常用于检测磷酸化蛋白。然而，传统Western技术通常耗时费力，需要许多手工操作步骤——从进行凝胶电泳到蛋白转膜、封闭、抗体孵育、洗涤和检测等。

激酶活性测定

激酶是酶中最重要的和研究最充分的成员。它们催化磷酸基团从ATP转移到各种细胞组成蛋白，许多细胞活动，包括细胞信号通路、细胞分裂和生长、发育、分化和细胞死亡，都由激酶协调作用。

在正常情况下，激酶活性受到严格调控。当它们调控异常时，细胞内的信号通路网络会发生混乱，从而导致疾病的发生，如癌症和炎症等。因此，激酶是药物发现和开发的重要靶标。通过检测激酶活性可了解细胞信号通路是否正常，但是这种检测只能一次检测少数通路，并且费时费力。

 Miltenyi Biotec

成立于2013年的IsoPlexis公司总部位于美国的康涅狄格州，是一家专注于单细胞多重功能蛋白质组检测解决方案的**科技公司。自2018年产品解决方案商业化以来，已在全球装机超过150台，是众多国际知名研究机构和制药企业的合作伙伴，相关文献发布超过100篇，并有多篇高影响因子文章发表在Nature、Cell、Immunology等刊物上。

IsoPlexis致力于提供广受赞誉的精准单细胞功能分析系统，助力加速对抗癌症及各种疑难疾病的进程。通过揭示细胞亚群中独特的免疫生物标志物，推动肿瘤免疫疗法及靶向治疗迈向更加精准、个性化的发展阶段。